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Scientific Reports volume 12, Número do artigo: 16579 (2022) Citar este artigo

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O rato do algodão (Sigmodon) é o modelo animal pré-clínico padrão-ouro para patógenos virais respiratórios, especialmente para o vírus sincicial respiratório (VSR). No entanto, sem um genoma de referência ou um transcriptoma publicado, os estudos que requerem análise da expressão gênica em ratos do algodão são severamente limitados. Os objetivos deste estudo foram gerar um transcriptoma abrangente de vários tecidos de duas espécies de ratos do algodão que são comumente usados como modelos animais (Sigmodon fulviventer e Sigmodon hispidus) e comparar e contrastar alterações na expressão gênica e respostas imunes à infecção por RSV entre as duas espécies. Transcriptomas foram montados a partir de pulmão, baço, rim, coração e intestinos para cada espécie com um contig N50 > 1600. A anotação de contigs gerou quase 120.000 anotações de genes para cada espécie. Os transcriptomas de S. fulviventer e S. hispidus foram então usados para avaliar a resposta imune à infecção por RSV. Identificamos 238 genes únicos que são significativamente expressos diferencialmente, incluindo vários genes implicados na infecção por RSV (por exemplo, Mx2, I27L2, LY6E, Viperin, Keratin 6A, ISG15, CXCL10, CXCL11, IRF9), bem como novos genes que não foram descritos anteriormente na pesquisa de RSV (LG3BP, SYWC, ABEC1, IIGP1, CREB1). Este estudo apresenta duas referências abrangentes de transcriptoma como recursos para futuros estudos de análise de expressão gênica no modelo de rato do algodão, bem como fornece sequências de genes para caracterização mecanicista de vias moleculares. No geral, nossos resultados fornecem informações generalizáveis sobre o efeito da genética do hospedeiro nas interações hospedeiro-vírus, bem como identificam novos alvos terapêuticos do hospedeiro para o tratamento e prevenção do RSV.

O vírus sincicial respiratório (VSR) é a principal causa de infecção do trato respiratório inferior (ITRI) em crianças menores de dois anos, bem como em indivíduos imunocomprometidos e idosos, resultando em 33 milhões de ITRs, 3,2 milhões de internações hospitalares e quase 120.000 mortes no mundo a cada ano1. Atualmente não há vacina aprovada para VSR e apenas um anticorpo monoclonal preventivo (Palivizumab), com uso limitado a crianças de alto risco devido aos custos2,3. Como 93% dos casos de ITRI por VSR e 99% da mortalidade por VSR ocorrem em países em desenvolvimento, a necessidade de uma vacina eficaz e de preventivos de baixo custo é crítica1. O fracasso da vacina RSV inativada com formalina na década de 1960, que induziu doença aumentada em vacinados ao encontrar o vírus, prejudicou o desenvolvimento de novas vacinas RSV por décadas4–6. No entanto, recentemente há um esforço renovado para desenvolver preventivos do VSR, com 14 candidatos a vacinas e estratégias antivirais alternativas contra o VSR (anticorpos recombinantes7, nanocorpos8, inibidores de moléculas pequenas e análogos9) que estão em vários estágios de desenvolvimento10. Isso destaca a necessidade crítica de um modelo pré-clínico apropriado para o desenvolvimento de vacinas e medicamentos contra o RSV.

O rato do algodão (gênero Sigmodon) é considerado o modelo animal "padrão ouro" para infecção por RSV em comparação com camundongos e outros animais porque é 100 vezes mais permissivo do que a maioria dos camundongos de laboratório à infecção por RSV e o RSV infecta tanto sua parte superior quanto inferior vias respiratórias semelhantes aos humanos11–13. Os ratos do algodão também previram com precisão a eficácia dos dois terapêuticos RSV aprovados pela FDA (RespiGam®, Palivizumab®)14–17. Além do RSV, ratos do algodão têm sido usados para estudar outros vírus respiratórios humanos importantes, ou seja, vírus influenza A18,19, vírus parainfluenza20,21, sarampo22, metapneumovírus humano23, enterovírus D6824 e rinovírus humano25, devido à ampla suscetibilidade e características comparáveis de doenças humanas26. Infelizmente, estudos comparando alterações transcriptômicas em ratos do algodão foram limitados devido à falta de genoma de referência publicamente disponível para qualquer espécie de rato do algodão. Anteriormente, publicamos um transcriptoma de tecido pulmonar induzido por RSV em S. hispidus27. No entanto, nesse estudo analisamos apenas a expressão em um tipo de tecido, e foi limitado a apenas uma espécie de rato do algodão (S. hispidus). Como mostram estudos anteriores, os específicos de S. fulviventer e S. hispidus diferem na gravidade da doença para patógenos virais (ou seja, vírus parainfluenza28, HIV29) e na estrutura da comunidade do microbioma30. Os principais objetivos deste estudo foram desenvolver transcriptomas abrangentes para ambas as espécies e comparar e contrastar as mudanças na expressão gênica após a infecção por RSV.

1600 (which exceeds N50 of other published transcriptome assemblies35,36,37). The Ex90N50, which is the N50 but limited to the top 90% of total normalized transcripts, was 2503 (S. fulviventer, #transcripts = 108,995) and 2162 (S. hispidus, #transcripts = 240,587) (Table 1)./p> 2, Euclidean distance) within individual tissue samples of both (C) S. fulviventer and (D) S. hispidus. (E) Principal component analysis (PCA) of expressed transcripts within healthy tissue of both species. (F) Taxonomic source of gene annotations determined by NCBI BlastX. Data represents annotations of S. fulviventer transcriptome; S. hispidus not shown but varies by ~ 1% in all categories except "other"./p> 70% is indicative of good quality. We also assessed transcriptome completeness by searching for evolutionarily-conserved BUSCO40 groups from the vertebrata_odb10 lineage dataset (total n = 3354) within our dataset. The S. fulviventer assembly had 92.7% complete BUSCOs (Complete:3109 [Complete&Single:785, Complete&Duplicated:2324], Fragmented:154, Missing:91), and S. hispidus had 90.2% complete BUSCOs (Complete:3025 [Complete&Single:2599, Complete&Duplicated:426], Fragmented:194, Missing:135). All assembly quality statistics are also shown in Table 1. Final reference transcriptome assemblies for each species are made available as supplementary file 1 (S. hispidus) and supplementary file 2 (S. fulviventer)./p> 30,000 annotated proteins per species (~ 17,000 proteins after filtering duplicate annotations). Proteins were further annotated based on protein domains (> 5000), transmembrane helices (> 18,000), and signaling proteins (> 7700). All annotation statistics can be found in Table 1, and the full annotation report can be viewed in supplementary file 3./p>

|1.0|) of S. fulviventer (blue) and S. hispidus (red), of which several genes were successfully annotated using Trinotate (as indicated in boxes). *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p ≤ 0.0001./p>

7), AMPure XP Beads for cleanup steps (Beckman, cat. No. A63881), and NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Set 1, cat no: E7600S) for pooling samples. Sequencing was performed using Illumina NovaSeq6000 2 × 150 bp sequencing at the Vanderbilt Technologies for Applied Genomics (VANTAGE) core facility./p> 1 was used to filter the low-quality assembled transcripts to use for differential expression analysis. The Ex90N50 was calculated using the Trinity contig_ExN50_statistic.pl script./p> 1 were used for downstream differential expression analysis (S. fulviventer = 270,451, S. hispidus = 474,882). Raw count matrices at the gene level for each species can be found in supplementary file 7 DESeq2 package38 was used within the pipeline to by compare experimental group (RSV-infected lungs) containing biological replicates with the corresponding control group (uninfected lungs). Genes with a p < 0.05, adjusted p < 0.05 ("q"/false discovery rate/Benjamini-Hochberg), and a log2 fold change >|1| were treated as differentially expressed. We used the goseq package in Bioconductor to detect differentially abundant GO terms44. GOs with a p < 0.05 and adjusted p < 0.05 ("q"/false discovery rate/Benjamini-Hochberg) were treated as differentially expressed./p>|1.0|)./p>